國家標準物質網質譜鑒定，常見疑問解答

問題1. 一級質譜和二級質譜有什么區別?什么時候做一級，什么時候做二級?
答：一級質譜鑒定的方式主要指胎指紋圖譜(PMF)，即利用質譜儀測量酶解片段的分子量并搜庫比較實現蛋白質的鑒定，二級質譜是在一級質譜的基礎上再選擇部分肽段做進一步的破碎并對碎片進行深入分析和比較，鑒定出該肽段的序列并結合PMF的結果從而實現蛋白質的鑒定。二級質譜能夠得到部分肽短的序列，具有更高的可靠性。隨著現在雜志對數據的要求越來越嚴格，二級質譜鑒定是蛋白鑒定的大趨勢，而且即使目前做一級質譜鑒定的結果，也需要挑選部分PMF結果做二級質譜驗證。

問題2. 研究的物種不是模式生物怎么辦?
答：可以參考親緣關系近的模式生物做比對而實現蛋白質的成功鑒定，如果質譜圖很好而沒有鑒定結果說明這是一個全新的蛋白，可以采用de-novo等技術做深入分析與鑒定。

問題3. 該如何評價質譜效果的好壞?
答：做PMF一般得分超過60分(P<0.05)就算成功鑒定，而串聯質譜，得分超過60分或者雖然沒有超過60分，但是有少一條肽段的得分超過30分就算成功鑒定。

問題4. 一些特殊的質譜方法有什么用途?
答：質譜的其它用途包括磷酸化位點分析、蛋白測序、混合蛋白鑒定(shotgun技術)以及分子量測定、二硫鍵位置分析等等。

問題5. 用什么染色方法比較好?
答：用考馬斯亮藍法進行染色，銀染也可以，但鑒定成功率稍低，并且推薦用串聯質譜對銀染蛋白進行鑒定可以大大提高鑒定成功率。

問題6. 凝膠是否可以長期保存?該如何保持?對鑒定效果有影響嗎?
答：如果保存時間超過一個月，可以用保鮮膜包裹后放入冰箱保持，如果小于一個月，則可以常溫保持，不會影響質譜鑒定效果。

問題7. 質譜鑒定取膠點該如何取?有什么注意事項?
答：取點的時候將0.2ml的槍頭前端剪去一點，用槍頭將凝膠戳取下來并轉移至0.5ml離心管中，用水將膠粒反復吸打沖洗兩至三次，吸干離心管中所有水分封蓋保存。離心管用進口離心管，以免塑料污染;水用去離子水或者雙蒸水;取點的時候帶好口罩與手套，以免角蛋白污染。

問題8. 凝膠是否可以長期保存?該如何保存?如何運送?
答：蛋白凝膠可以長期保存而不影響質譜鑒定效果，一般而言，如果在一兩個星期以內，用保鮮膜包好，放到4度冰箱保存，如果保存時間超過一個月，可以把蛋白點取下后放入-20度或者-80度冰箱，不會影響后續質譜鑒定效果。運送膠點的時候采用常溫運送即可，三五天內都不會有太大的影響。

問題9. 質譜鑒定取膠點該如何取?有什么注意事項?
答：取點的時候將0.2ml的槍頭前端剪去一點，用槍頭將凝膠戳取下來并轉移至0.5ml離心管中，用水將膠粒反復吸打沖洗兩至三次，吸干離心管中所有水分封蓋保存并做好標記。離心管用進口離心管，以免塑料污染;水用去離子水或者雙蒸水;取點的時候帶好口罩與手套，以免角蛋白污染。

問題10. 一級質譜與二級質譜該如何選擇?
答：一級質譜的鑒定方法又常稱為肽指紋圖譜鑒定(peptide-mass mapping，PMF)，二級質譜的鑒定方法又常稱為串聯質譜鑒定。早期蛋白鑒定，因為考慮鑒定成本的問題，一般做測序生物的蛋白鑒定可以選擇一級質譜，而非測序生物常選擇二級質譜。現在，二級質譜的價格也大大降低，和一級質譜并無太大差異，而且可靠性和鑒定成功率都大大提高，本公司一般都推薦客戶(不管是研究測序生物還是非測序生物)直接做串聯質譜，而不考慮進行肽指紋圖譜鑒定。

問題11. 質譜鑒定大致是什么流程，公司一般都提供那些數據?
答：質譜鑒定主要包括蛋白酶解、質譜數據獲取、對庫檢索三個步驟。針對每一個蛋白點的鑒定，一般會提供三種數據，具體包括：質譜圖(PDF格式，包括1張一級質譜圖和5-10張二級質譜圖)、質譜峰列表(text格式，主要是一些質譜碎片的信息)、檢索結果(自己建庫進行本地化檢索的一般提供的PDF格式或者excel格式，如果是Mascot在線檢索的一般提供網頁格式)。

問題12. 質譜鑒定會不成功一般有哪些因素?
答：質譜鑒定不成功主要可以分為兩類，一類是質譜效果不好，一類是沒有可參考的蛋白數據庫，質譜效果不好的原因又可以細分為蛋白點太淡以至于蛋白含量過低、蛋白點取得太小不利于操作、雖然經過雙向電泳分離但卻是某幾個蛋白的混合蛋白點、蛋白酶解及質譜操作失誤等，要避免這些因素需要盡量取顏色深一些的蛋白點，并且取的蛋白點面積需要適當大一些(對于某些很小但很清晰的蛋白點，取點的時候可是適當選擇孔徑大一些的槍頭，把邊上空白處適當取到一些也不要緊)，避免取點可能混合的蛋白點，具備豐富的酶解質譜操作經驗。而由于沒有可參考的數據庫導致的鑒定效果較差，可以通過更換范圍更大的數據庫、采用EST數據庫以及根據單個物種的蛋白數據庫構建本地質譜數據庫的方式得到解決。

問題13. 串聯質譜鑒定和質譜測序有什么區別?
答：質譜鑒定往往采用軟件對已有數據庫進行自動檢索匹配得到結果，而質譜測序則需要根據質譜峰圖中相鄰或者相近峰的分子量差異直接推算出肽段的序列。

問題14. 未知蛋白質是通過質譜還是蛋白質測序儀來測序的呢?
答：現在比較簡單的方法是質譜法，而且測一個樣品價格也不高。具體價格各個實驗室不一樣，100-500元吧。如果質譜法不能確定的話還可以結合N端測序，可測10幾個氨基酸。兩個數據結合分析基本可以確定目的蛋白了，現在的蛋白質組數據庫相當強大了。
 

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