動物源食品中硝基咪唑殘留量測定的前處理方法

硝基咪唑的危害及檢測目的

硝基咪唑類藥物（nitroimidazole,NMZs）是一類具有抗原蟲感染和抗厭氧菌的硝基雜環(huán)類抗菌藥物，其具有抗菌和抗原蟲作用。近年來作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中，同時也是一種生長促進(jìn)劑，以促進(jìn)畜禽的生長及改善飼料的轉(zhuǎn)換率。由于這類化合物含有的硝基雜環(huán)類物質(zhì)具有潛在致癌、致畸和致突變作用，因此歐美等發(fā)達(dá)國家已禁止在食源性動物中使用硝基咪唑類藥物。我國也對硝基咪唑類藥物進(jìn)行了嚴(yán)格的限制，2020年生效實施的GB 31650-2019《食品安quan國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥大殘留*》中僅規(guī)定了甲硝唑和地美硝唑兩種物質(zhì)允許作治療使用，但不得在動物性食品中檢出；同年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號，將洛硝達(dá)唑、替硝唑列入《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》中。

本文闡述了如何將硝基咪唑類化合物從樣品基質(zhì)中分離提取出來，并經(jīng)過凈化后，轉(zhuǎn)化成液質(zhì)聯(lián)用儀可以檢測的形式。以提取、凈化為重點，依據(jù)國標(biāo)GB/T 21318-2007，為檢測人員和相關(guān)領(lǐng)域研究人員提供一定的參考。

檢測項目：硝基咪唑類原藥及代謝產(chǎn)物

應(yīng)用范圍：豬肉/雞肉/牛肉/豬肝/雞肝/牛肝/豬腎/牛腎/魚肉/奶粉/蜂蜜

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

方法原理：樣品中殘留的8種硝基咪唑、2種代謝物用甲醇-丙酮均質(zhì)或超聲波提取，經(jīng)乙酸乙酯液液分配，以凝膠色譜（GPC）凈化，再經(jīng)固相萃取（SPE）凈化，采用液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜確證，外標(biāo)法定量測定。

前處理儀器：

凝膠色譜儀（配有餾份收集濃縮器）；組織搗碎機(jī)；均質(zhì)器；超聲波發(fā)生器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；高速離心機(jī)；氮吹儀；固相萃取裝置；具塞錐形瓶（250 mL）；分液漏斗（250 mL）；濃縮瓶（50 mL、250 mL）。

檢測儀器：LC-MS/MS+ESI源

前處理方法

1.提取

肌肉組織、臟器組織樣品及水產(chǎn)品

準(zhǔn)確稱取約20 g樣品（jingqque至0.1 g）于250 mL具塞錐形瓶中，加入10 g硅藻土（80目～120目）與樣品充分混勻，再依次加入5 mL飽和氯化鈉水溶液和70 mL甲醇-丙酮（3+1），高速均質(zhì)提取3 min。將提取液移入離心管中，于10000 r/min離心2 min，將上層提取液移入250 mL濃縮瓶中。殘渣每次再用50 mL甲醇-丙酮（3+1）重復(fù)提取兩次，合并提取液。

蜂蜜、乳及乳制品樣品

準(zhǔn)確稱取約20 g樣品（jingque至0.1 g）于250 mL具塞錐形瓶中，加入10 mL飽和氯化鈉水溶液和70 mL甲醇-丙酮（3+1），超聲波提取30 min。移入離心管中，于10000 r/min離心2 min，將上層提取液移入250 mL濃縮瓶中。殘渣每次再用50 mL甲醇-丙酮（3+1）重復(fù)提取兩次，合并提取液。

2.液液分配

將提取液于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至只剩水相，并轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，加入50 mL飽和氯化鈉水溶液和25 mL乙酸乙酯，振搖3 min，靜置分層，收集乙酸乙酯相。水相再用

20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取兩次，合并乙酸乙酯相。經(jīng)無水硫酸鈉柱脫水，收集于250 mL濃縮瓶中，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，加入5 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1）溶解殘渣，并用0.45 μm濾膜過濾，待凈化。

3.凈化

凝膠色譜（GPC）凈化

凝膠色譜凈化條件如下：

凈化柱：700 mm×25 mm，Bio Bcads S X3，或相當(dāng)者；

流動相：乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1）；

流速：4.7 mL/min；

樣品定量環(huán)：5.0 mL；

預(yù)淋洗體積：50 mL；

洗脫總體積：210 mL；

開始棄去體積：90 mL；

收集體積：90 mL；

后棄去體積：30 mL。

凝膠色譜凈化步驟如下：

將5 mL待凈化液按照凝膠色譜凈化條件進(jìn)行凈化，合并餾份收集器中的收集液于250 mL濃縮瓶中，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，加入5 mL甲醇以溶解殘渣，待凈化。

固相萃取（SPE）凈化

使用前用5 mL甲醇預(yù)淋洗C18固相萃取柱（1 g，6 mL），將5 mL溶解液傾入C18固相萃取柱中，以1 mL/min的速度收集流出液，再用10 mL甲醇進(jìn)行洗脫。收集全部洗脫液于50 mL濃縮瓶中，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干。用甲醇溶解并定容至1.0 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，供液質(zhì)測定和確證。

國標(biāo)解讀及注意事項

1.硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用甲醇配成1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在0 ～4 ℃條件下避光保存，可使用12個月。

2.如果有條件，建議凝膠色譜凈化系統(tǒng)中配合使用紫外檢測器，準(zhǔn)確監(jiān)測目標(biāo)化合物及雜質(zhì)的流出情況。

3.固相萃取凈化過程中，C18柱作為凈化柱使用，注意上樣過程中就需要收集流出液，再和洗脫液進(jìn)行合并。

4.國標(biāo)方法中使用基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法進(jìn)行回收率的校正。注意做肉類樣品的基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線前，先進(jìn)行洗滌，然后加標(biāo)，再進(jìn)行后續(xù)提取凈化等流程。

5.建議使用硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相對應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行回收率的校正。

參考文獻(xiàn)

GB/T 21318-2007 動物源食品中硝基咪唑殘留量檢驗方法

圖1 肌肉組織、臟器組織樣品及水產(chǎn)品中硝基咪唑殘留量測定的前處理流程圖

圖2 蜂蜜、乳及乳制品樣品中硝基咪唑殘留量測定的前處理流程圖